Šis pirmais ķirzakas ģenētiskās manipulācijas gadījums ir radījis paraugorganismu, kas varētu palīdzēt iegūt papildu izpratni par rāpuļu evolūciju un attīstību
CRISPR-Cas9 vai vienkārši CRISPR ir unikāls, ātrs un lēts gēns rediģēšanas rīks, kas ļauj rediģēt genomu, dzēšot, pievienojot vai mainot DNS. CRISPR akronīms apzīmē 'Clustered Regularly Inter-Spaced palindromic Repeats'. Šis rīks ir vienkāršs un precīzāks nekā iepriekšējās rediģēšanas metodes DNS.
CRISPR-Cas9 rīks injicē organismus zigotas (vienas šūnas) stadijā ar DNS konstrukciju, kas izgatavota no (a) Cas9 enzīma, kas darbojas kā “šķēres” un var nogriezt vai dzēst daļu DNS, (b) vadīt RNS — secību, kas sakrīt ar mērķa gēnu un tādējādi virza Cas9 enzīmu uz mērķa vietu. Kad DNS mērķa daļa ir izgriezta, šūnas DNS labošanas iekārta atkal pievienosies atlikušajai virknei un šajā procesā apklusinās mērķa gēnu. Vai arī gēnu var “labot”, izmantojot jaunu modificētu DNS veidni procesā, ko sauc par homoloģiju vērstu labošanu. Tādējādi CRISPR-Cas9 rīks ļauj veikt ģenētiskas modifikācijas, injicējot gēnu rediģēšana šķīdumus vienšūnas apaugļotā olā. Šis process izraisa ģenētiskas izmaiņas (mutāciju) visās turpmākajās šūnās, kas tiek ražotas, tādējādi ietekmējot gēnu darbību.
Lai gan CRISPR-Cas9 regulāri izmanto daudzām sugām, tostarp zivīm, putniem un zīdītājiem, līdz šim ar to nav izdevies ģenētiski manipulēt ar rāpuļiem. Tas galvenokārt ir divu šķēršļu dēļ. Pirmkārt, rāpuļu mātītes spermu ilgstoši uzglabā olšūnā, tāpēc ir grūti noteikt precīzu apaugļošanās laiku. Otrkārt, rāpuļu olu fizioloģijai ir daudzas iezīmes, piemēram, lokanās olu čaumalas, trauslums bez gaisa telpas iekšpusē, kas apgrūtina manipulācijas ar embrijiem, neizraisot plīsumus vai bojājumus.
Rakstā, kas augšupielādēts vietnē bioRxiv 31. gada 2019. martā pētnieki ziņoja par CRISPR-Cas9 izmantošanas veida izstrādi un testēšanu. gēnu rediģēšana rāpuļos pirmo reizi. Pētījumā izvēlētā rāpuļu suga bija tropiska ķirzaka aicināja Anolis sagrei vai biežāk brūnais anols, kas ir plaši izplatīts Karību jūras reģionā. Pētījumā iekļautās ķirzakas tika savāktas no savvaļas reģiona Floridā, ASV. Šī suga ir ideāli piemērota pētījumam tās miniatūra izmēra, garās vairošanās sezonas un salīdzinoši īsā vidējā laika starp divām paaudzēm dēļ.
Lai pārvarētu ierobežojumus, ar kuriem pašlaik saskaras rāpuļi, pētnieki mikroinjicēja CRISPR komponentus nenobriedušās neapaugļotās olās, kamēr olas pirms apaugļošanas vēl atradās sieviešu kārtas ķirzaku olnīcās. Tie bija vērsti pret tirozināzes gēnu, kas ražo fermentu, kas kontrolē ķirzaku ādas pigmentāciju, un, ja šis gēns tiek noņemts, ķirzaka piedzims kā albīns. Šis skaidrais pigmentācijas fenotips bija iemesls tirozināzes gēna izvēlei. Pēc tam mikroinjicētās olas nobriest mātītes iekšpusē un pēc tam tiek dabiski apaugļotas ar ievadītu tēviņu vai uzglabātu spermu.
Rezultātā pēc dažām nedēļām piedzima četras albīnu ķirzakas, kas apstiprināja, ka gēnu tirozināze ir deaktivizēta un gēnu rediģēšana process bija veiksmīgs. Tā kā pēcnācēji saturēja abu vecāku rediģēto gēnu, bija skaidrs, ka CRISPR komponenti mātes nenobriedušajā olšūnā palika aktīvi daudz ilgāk un pēc apaugļošanas mutēja tēva gēnus. Tādējādi mutantu albīnu ķirzakas uzrādīja manipulētu tirozināzi gēnos, kas mantoti gan no mātes, gan no tēva, jo albīnisms ir īpašība, kas mantota no abiem vecākiem.
Šis ir pirmais pētījums, kas efektīvi ražo ģenētiski modificētus rāpuļus. Pētījums varētu darboties līdzīgi citām ķirzaku sugām, piemēram, čūskām, kurām pašreizējās pieejas līdz šim nav bijušas veiksmīgas. Šis darbs varētu palīdzēt iegūt papildu izpratni par rāpuļu evolūciju un attīstību.
***
{Šis pētījums pašlaik ir iesniegts salīdzinošai pārskatīšanai. Varat izlasīt pirmsdrukas versiju, noklikšķinot uz DOI saites, kas norādīta tālāk citēto avotu sarakstā}
Avots (-i)
Rasys AM et al. 2019. Priekšdruka. CRISPR-Cas9 Gēnu rediģēšana ķirzakās ar neapaugļotu olšūnu mikroinjekciju. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
